Метод электрофореза в агарозном геле

Метод электрофореза в агарозном геле

Так как описываемый метод электрофореза в агарозном геле позволяет в одном гелевом блоке выявлять групповые изоферменты ЭсЭ и ГЛО I, то после выявления фенотипов 3cD фильтровальную бумагу, смоченную раствором 4-метилумбеллиферилацетата, удаляют и агарозный гель окрашивают для выявления групповых нзоферментов глиоксалазы I. Для этого необходимо соблюсти два условия: 1. Кусочек фильтровальной бумаги шириной 10 см смачивают б мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 6,8, содержащего 60 мг восстановленного глутатиона (GSII) и 0,6 мл метилглпоксаля. Инкубацию проводят в термостате при 37 С в течение 20 мин. 2 В 5 мл 0,3 М раствора триса растворяют 24 мг МТТ, а в 2 мл 0,1 М раствора триса растворяют 0,5 мг 2,6-дихлорфенолнндофенола (ДХФИФ). 2 В 5 мл 0,3 М раствора триса растворяют 24 мг МТТ, а в 2 мл 0,1 М раствора триса растворяют 0,5 мг 2,6-дихлорфенолнндофенола (ДХФИФ). В 13 мл дистиллированной воды растворяют 0,1 г агарозы, кипятят и раствор агарозы охлаждают до 56 °С. После этого в него добавляют растворенные по отдельности МТТ и ДХФИФ.

Фильтровальную бумагу, смоченную фосфатным буфером, содержащим GSH и метилглиоксаль, снимают с поверхности геля п на него выливают только что приготовленный раствор, содержащий МТТ и ДХФИФ. В местах проявления ферментативной активности глиоксидазы I (расположения ее групповых изоферментов) наблюдается отчетливое просветление на общем темно-синем фоне агарозного геля. Принцип выявления ферментативной активности глиоксалазы I состоит в том, что на первом этапе в присутствии глиоксалазы из метнлглиоксаля и GSIT образуется S-лактоилглутатион, в то время как на участках агарозного геля, в которых отсутствует глиоксалаза, неизмененный глутатион редуцирует МТТ, ч+о приводит к выпадению нерастворимых гранул фиолетового формазана.

1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд (Еще не оценили)
Загрузка ... Загрузка ...

Оставить комментарий

Почта (не публикуется) Обязательные поля помечены *

Вы можете использовать эти HTML теги и атрибуты: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Подтвердите, что Вы не бот — выберите человечка с поднятой рукой: